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                新闻中心
                2021-12
                溶剂效应消除器在HPLC方法中的应用

                1、溶剂效应

                ?溶剂效应(solvent effect)亦称“溶剂化作用”。指液相反应△中,溶剂的物理和化学性质影响反应平衡和反应速度↓的效应。可能造成色谱峰ω展宽、分叉、保留时间漂↑移、峰面积变化,双峰等①现象。与此同时,较早洗脱的∩峰出现前延或分叉,较晚洗脱的峰峰形正常1

                ? ? ? ? ??溶剂效应主要产生于进样过程,究其原因,样品溶液(包括样品分子和溶剂分子)在进样过程中☆实际上存在着三个进程,一是样品分子与流动相混合,二∴是样品分子与固定相发生相互作用,三是样品分子在流动相的推动下被洗脱。当样品到达色谱柱时样品的这三个进程是同时进行的,一旦样品溶液与流动相︻兼容性不好,样品未能充分进入良好的预分离状态即被仓促洗脱,就会产生引起怪异峰型的溶剂效应,影响分离度和分析结√果的准确性。

                2、溶剂效应消除器

                ? ? ? 溶剂效应消除器又叫峰形前延抑制器,它的设计●原理是在色谱柱前端引入一个特●殊结构的腔体,使其内部空腔在色谱系统平衡过程中充〖满流动相,进样时ξ样品溶液流经腔体,在其极小体积的空腔内产生微小的湍流,使样品溶液到达色谱前与存留与空腔内的流动相高效混♀合,优化了样品分子所处的周围环ξ 境,使同时进行的三个进程得到了微妙的改善,使样品在到达色谱柱之前即完成了样品溶液与流动相的兼容性◥问题,提前进入预分离状态,样品到达色谱柱后【即可以最佳的状态被流动相洗脱进行分析分离,由此消除了溶剂效应。(来自谱宁科技)

                3、应用实例

                塞来昔布(Celecoxib),即4[5-4(4-甲苯基)-3-(三氟甲基)-1氢-1-吡唑-1-基]苯磺酰胺,是第一个◤选择性COX-2抑制剂,也是目前全球处方量最大的非甾体类抗炎镇痛药(NSAIDs),不仅具有显著镇痛疗◇效,能显←著减轻关节触痛、疼痛和关节肿胀,而且具有优越的胃肠道安全性。已知ㄨ塞来昔布原料药生产过程中可有由剩余起始物料和第二步反应物料反应生成杂质D,该化合物具有基因毒性杂□ 质警示结构苯肼结♂构,被ICH M7定义为3类基因毒性杂质(即具有警示结构,与原料药◎结构无关;无致突』变性数据),需要对其进行严格的限度控制。为更好的监控塞来昔布胶囊产品质量,按照ICH规定〓基因毒性杂质的人体摄入量不能超过每人每天1.5μg,我们参考美国药典论坛方法卐2建立了塞来昔布杂质D的HPLC-UV测定法,对塞来昔布胶囊中可能存在的杂质D进行检测,可以更好的控制塞来昔布及其制剂的产品质量█。

                ? ? ? ?塞来昔布杂质D结构式如下:

                杂质D.png

                ? ? ? ?塞来昔布胶▼囊杂质D检测方法描述如下:

                ? ? ? ?①流动相。流动相A:0.10%磷酸溶液;流动相B:甲醇-乙腈-水(50:20:30);如下梯度洗脱:

                ? ? ? ? ?流动相.png

                ? ? ? ②色谱柱:Purospher STAR RP-18(4.0mm×5.5cm,3μm)或性能相当的色谱柱。

                ? ? ? ③检测波长:330nm。

                ? ? ? ④柱温:30℃。

                ? ? ? ⑤进样体积:20μl。

                ? ? ? ⑥溶剂:甲醇-乙腈(80:20)。

                ? ? ? ⑦供试←品溶液:取本品20粒,倾倒出内容物,计算其平均装量,并混】合均匀,取内容物约2.2g(相当于№塞来昔布1.6g),精密称定,置20ml量瓶中,加入约16ml稀释液,超声5min使溶解,放冷,用稀释液稀释至刻度,摇匀,4000rpm/min离心5min,取上清液,即得。

                ? ? ? ⑧对照品溶△液↓:取塞来昔布杂质D对照品约15mg,精密称定,置100ml量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为杂质D储备液,精密量取杂质D储备液1ml至50ml量瓶中,用稀释液稀释至刻度,摇匀,再精密量取5ml至50ml量瓶中,用稀释液稀释至刻度,摇匀即得。(杂质D浓度约为0.3μg/ml)。

                实验1

                ? ? ??参考美国药典论坛色谱条件,在Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色谱仪上进样杂质D对照品溶液,结果■显示杂质D峰出现峰前延(如图1)。

                TEST1.png

                实验2

                ? ? ?考虑到样品配制用溶剂和流动相不一致,存在样品溶液与流动相的兼容性问题,可能引起溶剂效应。为证明溶剂效应的存在,改用∞流动相稀释杂质D对照品溶液,在相同仪器上重新进样,结果】显示杂质D峰形正常(如图2)。证明确实存在溶剂♀效应。

                TEST2.png

                实验3

                ? ? ?参考美国药典论坛色谱条件,在岛津LC2030型高效液相色谱仪上重新进样杂质D对照品溶液,发现不使用流动相稀释的杂质D对照品溶液色谱图杂质D峰形却是正常的(如图3)。

                TEST3.png

                ? ? ? ? ??对比两台高效液相色谱仪的构造,岛津LC2030连接管线采用了0.3mm内径的不锈钢管(如图4),比Agilent 1260Ⅱ的0.17mm内径不锈钢管线(如图5)粗了将近一倍,样品从进样至进入色谱柱之前,在0.3mm管线中有足够大的体积使样品溶液和流动相充分混合,样品提前进入预分离状态,消除了溶剂效应带来的影响,使色谱图杂质D峰型正常。

                TEST4.png

                实验4

                ? ? ? ? ??市面上能提供峰前延抑制器的产品的公司众多,此次试验采用的是上海谱Ψ 宁分析技术有限公司生产的Pntulips?郁金香系列Solvnet-Smoother 溶剂效应消除器(Solvs-AB型),将消除※器接于Agilent 1260Ⅱ型的进样器与色谱柱之间,参考美国药典论坛色谱条件进样杂质D对照品溶液。结果显示杂质D峰形正常(如图6)。

                TEST5.png

                4、讨论

                液相色谱方法开发中应尽量避免使用比流动性强的溶剂来配备样品,通常可采用流动相做溶剂。如果不方便更换样品溶剂,要注意可能的溶剂效应使色谱图中较早洗脱出来的色谱峰发生谱带加宽和(或)扭曲变形;同时需关注此类方法的方法转移█时,因为不同实验室检测设备的差异导致可能的方法转移失败。此时在色谱系统中加装峰前延抑制器是一种不错的解决方案。

                参考文献

                [1] Lee H K , Hoffman N E . INJECTION SOLVENT EFFECT ON PEAK HEIGHT IN ION-EXCHANGE HPLC[J]. Journal of Chromatographic Science, 1992,30(10):415-421.

                [2] 436In-Process Revision Celecoxib.