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                新闻中心
                2022-01
                浅谈原子吸收分光光度法的方法验证要点

                1.原子吸收分光光度法

                原子吸收光谱法(Atomic Absorption Spectroscopy,AAS),又称原子吸收分光光度法,是基于待测元素的基态原︼子蒸汽对其特征谱线的吸收,由特征谱线的特征性与谱线被减弱的程度对待测元素进行〓定性定量分析的一种仪器分析的方法。

                原子吸收分光光度法具有∩选择性强、灵敏度高、精密度高的优点,适用于药品中作为杂质存在的特定元素含◢量的测定,中国药典四部使用原子吸收分光光度法进行元素杂质砷、镉、铅、汞、铜的测定。


                2.AAS方法的方法验证要点

                为证明建立的方法适用于相应检测要求,在建立药品分析方法时需对分析方法进行验证。根据EDQM出版的Technical Guide for the Elaboration of Monographs中相关介绍,原子吸收分光光度法方法除常规进行准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围项验证外,需要重点关注以下∏几项内容:

                ? ? ? 2.1.专属性

                理论上,选取合适的光源和波长,使用原子吸收分光光度法进行特定元素的测定,方法专属性是合格的。但是,因为原子以不连续的线光谱形式发射或吸收辐射,由于光学和/或化∏学因素,原子吸收分光光度法可能会遇到干扰。如果采用直接标准曲线法(中国药典2020年版通则0406第一法),这些干扰因素可能会导致测定的系数误差或降低方法的灵敏度,原子吸收分光光度法最重要的误差来源于标准曲线的操作以及基质的干扰。所以,原子吸收方法需要进行专属性验证。

                2.2.标准曲线

                制备水溶性对照品溶液,并对分布在标准曲线范围内的不同浓度水平的对照品溶液进行分析。必须制备的不同浓度水平对照品溶液的数量取决于所用的标准曲线方法。为证明标准曲线符合直线回归模型,应至少配制5份不同浓度的对照品溶液;抛物回归模型也要求至少配制5份对照品溶液。首选的对照品溶液浓度水平是在标准曲线范围内平均分布。

                一般地,每个浓度水平至少测定5次。

                校准程序通常是通过目视就能判断合格与否。但不能仅仅使用标准曲线图来证明校准程序的适用性。

                以测得」的吸光度值为纵坐标,相应的浓度为横坐标,绘制标准曲线得出回归方程和置信区间,测定的数据点应与拟合曲线想适配。

                ? ? ? ?②残差(即测定值与标准曲线上的估计值之间的差),绘制残差与浓度的关系,当建立了适当的标准曲线时,残差应随机分布在x轴附近。

                ? ? ? ?2.3.基质效应

                当以水溶性对照品溶液为标样进行测定,对标准曲线方程进行评估,必须确保供试品溶液和水溶性对照品溶液具有相近的灵敏度。当采用线性回归模式时,可通过标准加入法与水溶性标样标准曲线的截距的比较,来确定标样与供试品溶液间的检测灵敏度的差异。对两种线性回归的截距估计值的精密度程度,取决于测定数据点的数量及其在拟合曲线上的分布情况。因此,两种回归曲线的建立过程中应有足够的数据点(大于5个),这些标样的浓度应主要分布在标准曲线的测定范围内。

                2.4.检测限和定量限

                为了对检测限和定量※限进行估算,需要配制具有代表性的空白溶液进行测定。

                基质空白为首选,因为该溶液中除了待测物质外,含有供试溶液中的所有组分。但是,当不能获得基质■空白时,可以按照供试品溶液的配法,制备含有供试品中所含全部试剂的试剂空白溶液。


                3.验证实例:

                ? ? ?根据中国药典2020年版,葡萄糖酸锌原料药的铅盐检测采用理化分析方法,方法中使用到氰化钾,氰化钾属于剧毒物质,所以改用原子吸收分光光度法(标准加入法)进行检测。

                ? ? ? 3.1.溶液配制如下:

                ? ? ??标准曲线法线性溶液:分别精密量取10μg/ml铅标准溶≡液0.6ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml,置250ml分液漏斗中,加入9mol/L盐酸溶液20ml、水20ml,再加入抗坏血酸-碘化钠溶液40ml、三正辛基氧膦∮溶液10ml,振摇30s,静置分层,弃去水相,将有机相放入10ml具塞刻度试管中。

                ? ? ??标准█加入法线性溶液:分别取◣葡萄糖酸锌原料药2.0g,精密称定,置100ml烧杯中,加9mol/L盐酸溶液20ml使溶解,用20ml水冲洗转移到250ml分液漏斗中,精密加入10μg/ml铅标准溶液0.6ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml,再加入抗坏血酸-碘化钠溶液40ml、三正辛基氧膦溶液10ml,振摇30s,静置分层,弃去水相,将有机相放入10ml具塞刻度试管中。

                ? ? ? 3.2.分别进样检测,得到相应的标准曲线,进行结果对比:

                ? ? ? ?验证结果

                ? ? ? ??验证结果.png

                ? ? ? ?加标标准曲线斜率与标准曲线斜率比值:0.014646/0.015808=0.93;

                ?加标标准曲线截距偏差与标准曲线截距偏差比值:0.0016813/0.0026676=0.63;

                ?截距偏差比值显然太小,说明葡萄糖酸锌原料药的铅盐检测方法存在基质干扰,需要采用标准加入法进行样品检测。

                3.3.使用标准加入法的线性测定结果进行检测和定量限估算:

                空白溶液配制:取原料药2g,精密称定,置100ml烧杯中,加9mol/L盐酸溶液20ml使溶解,用20ml水冲洗转移到250ml分液漏斗中,加入抗坏血酸-碘化钠溶液40ml、三正辛基氧膦溶液10ml,振摇30s,静置分层,弃去水相,将有机相放入10ml具塞刻度试管中。平行配制5份。

                空白溶液检测:在283.3nm处,使用空气-乙炔火焰,将原子吸收分光光度仪调至最佳工作状态,以甲基异丁基甲酮调零,分别测定试剂空白溶液各1次,记录系列溶液的吸光度。

                平行5份空白溶液的吸光度值分别为-0.0014-0.0013-0.0013-0.0015-0.0015,算得标准偏差为0.0001

                结合标准加入法的线性回归方⊙程y=0.015808x-0.0079676,斜率为0.015808

                ? ? ? ?算得检测限为:3.3×0.0001÷0.015808=0.0209μg/ml;定量限为:10×0.0001÷0.015808=0.0632μg/ml


                4.结果讨论

                ? ? ?在建立质量标准时,如果法定方法不适用,需要转移思路〒,进行方法开发。建立能够显著改善灵敏度、精密度、准确度和专属性的新方法,方法验证需要系统、全面、科学,以证明其适用于指定用途,而不是仅仅为了进行方法验证而验证。


                参课文献

                [1] Technical Guide for the Elaboration of Monographs,European Pharmacopoeia

                [2] 中国药典2020年版-葡萄糖酸锌